RT-PCR czy PCR: na czym polega różnica?
Skróty PCR i RT-PCR są podobne, ale nie oznaczają tej samej procedury. PCR, czyli reakcja łańcuchowa polimerazy, służy do wielokrotnego powielania wybranego fragmentu DNA. Z kolei RT-PCR obejmuje dodatkowy etap odwrotnej transkrypcji, który pozwala rozpocząć analizę od RNA. To rozróżnienie ma znaczenie zarówno w diagnostyce, jak i badaniach nad ekspresją genów czy funkcjonowaniem układu nerwowego.
W klasycznej PCR polimeraza DNA kopiuje wybrany fragment materiału genetycznego w kolejnych cyklach. Po zakończeniu reakcji produkt najczęściej ocenia się metodą elektroforezy. Taki odczyt pozwala zwykle stwierdzić, czy poszukiwany fragment został wykryty, ale nie określa precyzyjnie jego początkowej ilości.
W RT-PCR przed amplifikacją RNA jest przepisywane na komplementarne DNA, nazywane cDNA. Proces ten przeprowadza enzym odwrotna transkryptaza. Dopiero powstałe cDNA może zostać powielone z użyciem PCR. Metodę stosuje się między innymi do analizy RNA wirusów oraz badania ekspresji genów.
Najkrócej: PCR opisuje powielanie DNA, a oznaczenie RT informuje o wcześniejszym przepisaniu RNA na cDNA. Nie mówi ono samo w sobie, czy ilość produktu jest mierzona w czasie reakcji.
Jak przebiega PCR i co zmienia qPCR?
W typowej reakcji PCR próbka przechodzi powtarzane cykle temperaturowe. Najpierw ogrzewanie rozdziela dwie nici DNA. Następnie startery, czyli krótkie sekwencje wyznaczające obszar analizy, przyłączają się do odpowiednich fragmentów. Polimeraza DNA syntetyzuje nowe nici, a uzyskane kopie stają się matrycami w kolejnych cyklach. W efekcie liczba kopii wybranego celu rośnie.
W klasycznej PCR produkt jest analizowany po zakończeniu amplifikacji. qPCR, czyli ilościowa PCR w czasie rzeczywistym, pozwala natomiast śledzić narastanie produktu podczas kolejnych cykli. Aparat rejestruje fluorescencję, której źródłem może być barwnik wiążący dwuniciowe DNA albo sonda rozpoznająca konkretną sekwencję. Pomiar odbywa się zwykle po każdym cyklu.
Gdy sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony próg, określa się cykl jako Ct lub Cq. Przy porównywalnych warunkach niższe Ct/Cq zwykle wskazuje na większą początkową ilość celu, ponieważ sygnał pojawił się wcześniej. Nie jest to jednak uniwersalna miara, którą można bez zastrzeżeń porównywać między różnymi testami. Wartość zależy między innymi od wydajności reakcji, ustawionego progu i warunków laboratoryjnych.
Czym jest RT-qPCR i dlaczego nazwy bywają mylące?
RT-qPCR łączy odwrotną transkrypcję z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Najpierw RNA jest przekształcane w cDNA, a następnie amplifikacja cDNA jest monitorowana za pomocą fluorescencji. Nazwa opisuje zatem dwa elementy procedury: konwersję RNA do cDNA oraz śledzenie produktu podczas reakcji.
Skrót RT-PCR bywa niejednoznaczny. Najczęściej oznacza PCR poprzedzoną odwrotną transkrypcją, ale w niektórych materiałach jest używany jako określenie PCR w czasie rzeczywistym. To może prowadzić do nieporozumień, ponieważ odwrotna transkrypcja i pomiar ilościowy są odrębnymi cechami metody.
Dla większej precyzji warto rozróżniać trzy terminy:
- PCR powiela DNA, a produkt jest zwykle oceniany po zakończeniu reakcji.
- qPCR powiela DNA i monitoruje narastanie produktu w czasie rzeczywistym.
- RT-qPCR przepisuje RNA na cDNA, a następnie mierzy amplifikację cDNA w czasie rzeczywistym.
Ważne jest również to, że test RT-qPCR może służyć wyłącznie do odpowiedzi jakościowej, na przykład do stwierdzenia, czy wykryto określoną sekwencję RNA. Sama obecność pomiaru fluorescencji podczas reakcji nie oznacza, że wynik jest dokładnym pomiarem ilości materiału w próbce. Testy wykrywające wybrane sekwencje RNA SARS-CoV-2 są przykładem zastosowania RT-qPCR, w którym wynik diagnostyczny może być podawany jako wykrycie lub niewykrycie celu.
Jak dobrać metodę do próbki i pytania badawczego?
Wybór procedury zależy przede wszystkim od rodzaju badanego materiału oraz tego, na jakie pytanie ma odpowiedzieć analiza. Jeśli celem jest fragment DNA, można zastosować PCR, a gdy istotne jest śledzenie ilości produktu podczas amplifikacji, qPCR. Jeśli materiałem wyjściowym jest RNA, potrzebny jest etap odwrotnej transkrypcji. W zależności od celu badania można wtedy wykorzystać RT-PCR albo RT-qPCR.
W badaniach ekspresji genów analiza RNA pozwala ocenić, czy określone transkrypty są obecne i jak zmienia się ich poziom w porównywanych próbkach. W badaniach wirusów RNA odwrotna transkrypcja umożliwia przygotowanie materiału do amplifikacji. Natomiast w badaniach neurologicznych dobór metody powinien odpowiadać konkretnemu celowi, na przykład wykrywaniu sekwencji albo ilościowemu porównaniu ekspresji w odpowiednio przygotowanych próbkach.
qPCR ma własne parametry jakościowe. Wydajność amplifikacji opisuje przyrost produktu na cykl. Wartość 2 oznacza podwojenie ilości produktu, czyli wydajność 100%. W praktyce za akceptowalny zakres często uznaje się 90-110%. Ocenę przeprowadza się między innymi na podstawie serii rozcieńczeń i krzywej standardowej. Dla reakcji o wydajności bliskiej 100% nachylenie krzywej wynosi orientacyjnie około −3,3, a jakość dopasowania może być oceniana przez R² > 0,99.
Wydajność nie pozostaje nieograniczona przez cały przebieg reakcji. Po około 30-40 cyklach amplifikacja zwykle traci sprawność między innymi z powodu wyczerpywania reagentów, nagromadzenia produktów ubocznych i spadku aktywności enzymu. Dlatego interpretacja sygnału wymaga uwzględnienia zakresu, w którym reakcja działa wiarygodnie.
Co wpływa na wiarygodność wyniku?
Technologia nie jest jedynym czynnikiem decydującym o wyniku. Znaczenie mają jakość i sposób pobrania próbki, przygotowanie materiału, projekt starterów, swoistość testu, obecność inhibitorów oraz kontrola zanieczyszczeń. Ponieważ PCR jest bardzo czuła, nawet śladowa ilość obcego materiału genetycznego może wpłynąć na rezultat.
Nieswoiste przyłączanie starterów i tworzenie ich dimerów mogą obniżać wydajność albo utrudniać interpretację. Inhibitory obecne w próbce mogą zakłócać działanie enzymów, a niewłaściwie dobrane warunki reakcji mogą prowadzić do słabego lub nieswoistego sygnału. Z tego powodu wiarygodna analiza obejmuje odpowiednie kontrole i ocenę jakości procedury, a nie tylko odczyt z aparatu.
Wynik ujemny nie zawsze wyklucza obecność badanego celu. Materiału genetycznego może być zbyt mało, próbka mogła zostać nieprawidłowo pobrana lub przygotowana, a amplifikację mogą zakłócać inhibitory. Również Ct/Cq nie ma jednego uniwersalnego progu, który samodzielnie rozstrzygałby o wyniku każdego testu. Wartość tę interpretuje się zgodnie z walidacją danej metody, jej progiem i kontrolami.
W opisie wyniku powinny znaleźć się informacje o celu testu, zastosowanej metodzie, sposobie pobrania i przygotowania próbki oraz ograniczeniach interpretacji. Współczesny rozwój diagnostyki obejmuje łączenie odwrotnej transkrypcji z ilościowym pomiarem fluorescencji, automatyzację oraz zamknięte systemy, które ograniczają manipulację próbką i integrują jej przygotowanie z analizą. Niezależnie od użytej platformy podstawowa zasada pozostaje taka sama: PCR powiela DNA, RT umożliwia analizę RNA, a qPCR śledzi amplifikację w czasie rzeczywistym.
Bibliografia
- https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/gene-expression-analysis-real-time-pcr-information/introduction-gene-expression.html
- https://www.promega.com/resources/guides/nucleic-acid-analysis/qpcr-and-rt-qpcr-amplification/
- https://milnepublishing.geneseo.edu/molecular-techniques/chapter/week-2-rt-qpcr/
- https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/rt-qpcr
- https://extranet.who.int/prequal/sites/default/files/document_files/EUL_0488-184-00_3DMed2019-nCoV_RT-qPCR_detectionKitFinalPR.pdf